Összefoglalás. A szerzők rövid áttekintést adnak a nem haemotrop, kutya eredetű mycoplasmákról, valamint beszámolnak az MgSZH ÁDI Debreceni Telephelyén, 2006–2010 között, ebekből kimutatott mycoplasmák faji meghatározásáról. A nemi utakból és a légutakból származó 29 mintát a 16S-23S rRNS intergenikus spacer (IGS) régióra tervezett PCR-RFLP-módszerrel vizsgálták. A légutakból származó mintákban M. canis (1), M. spumans (4), M. maculosum (1), a nemi utakból M. canis (4), M. cynos (4), M. edwardii (1) és M. mucosicanis sp. nov (1) fajokat mutattak ki.
(Mycoplasma infection of dogs
Summary. The authors give a short overview of the non haemotropic canine mycoplasmas and report the result of the species identification of canine mycoplasmas detected from 2006 to 2010 in Debrecen site of Central Agricultural Office Veterinary Diagnostic Directorate. The samples originating from the respiratory and genital tract were identified and differentiated by 16S-23S rRNA IGS PCR-RFLP. The tested species were found to be M. canis; M. spumans, M. maculosum, M. cynos, M. edwardii és M. mucosicanis sp. nov.)
A mycoplasmák a Mollicutes osztály, Mycoplasmatales rend, Mycoplasmataceae család Mycoplasma genusába tartozó, sejtfal nélküli mikroorganizmusok. Elnevezésük és rendszertani besorolásuk az új fajok leírásával és a filogenetikai vizsgálatok bevezetésével folyamatosan változik. Kutyákból M. arginini, M. bovigenitalium, M. canis, M. cynos, M. edwardii, M. feliminutum, M. felis, M. gateae, M. maculosum, M. molare, M. opalescence, M. spumans, M. mucosicanis sp. nov., M. haemocanis (korábban Haemobartonella canis), Candidatus M. haematoparvum, M. sp. VJC358 és M. sp. HRC689 fajokat írtak le (3, 17). Az M. haemocanis és a Candidatus M. haematoparvum fajok a kutya vörösvérsejtjein élnek, ezért ezeket a mycoplasmákat haemoplasmáknak, ill. haemotrop mycoplasmáknak is nevezzük. A nem haemotrop mycoplasmák többsége jól tenyészthető a kereskedelmi forgalomban kapható Mycoplasma-táptalajokon, 37 oC-on mikroaerofil körülmények között. Telepmorfológiájuk jellemzően tükörtojásra emlékeztető, de fajon belüli eltérések is lehetnek. A kevert fertőzések gyakorisága miatt, fajmeghatározás céljából, különálló telepek vizsgálata szükséges. Az acholeplasmáktól és az ureaplasmáktól való elkülönítésük alapja a digitoninérzékenység és az ureázbontás vizsgálata. Biokémiai próbák segítségével a fajon belül csak csoportszintű elkülönítés lehetséges (3), a faj meghatározása hagyományosan szerológiai módszerekkel történik. Az immunfluoreszcencia és a növekedésgátlási próba a leggyakrabban alkalmazott módszerek. A rutin diagnosztikai laboratóriumokban azonban nem állnak rendelkezésre fajspecifikus savópanelek és előfordulhatnak szerológiai keresztreakciók is (13, 16).
A polimeráz láncreakció (PCR) a DNS alapú Mycoplasma-kimutatás és a -tipizálás érzékeny eszköze. Az utóbbi években rohamosan nőtt a rendelkezésre álló szekvenciák száma. Ezek többsége a 16S rRNS kódoló génre, ill. a 16S-23S rRNS IGS szekvenciákra vonatkozik. A Mycoplasma-szekvenciák elemzése során megállapították, hogy a 16S rRNS gén nagymértékű homológiájával szemben, az rRNS operon spacer regiójának hossza és szekvenciája olyan mértékű heterogenitást mutat, ami felhasználható a fajok elkülönítésében (1, 6, 18, 19). CHALKER és mtsai (2) kidolgoztak kutyafajra fajspecifikus mycoplasmák kimutatására alkalmas PCR-rendszereket. Ezek alkalmazása azonban több PCR-reakció elvégzését igényli, ami a rutindiagnosztikai laboratóriumokban jelentősen megnöveli a vizsgálati időt és költséget. Ezt a nehézséget küszöbölte ki a SPERGSER és mtsai (16) által közölt, a 16S-23S rRNS IGS régióra tervezett PCR-RFLP-módszer. Ennek alkalmazásával a PCR-reakció során keletkezett termék mérete alapján csoportosított fajokat más-más restrikciós enzimekkel emésztve, a fajra jellemző hasítási mintázatot írtak le.
A kutyákból izolált mycoplasmák egy része más állatfajból (macska, szarvasmarha, juh, ló, kecske), valamint emberből is kimutatható (3). Elsősorban a légutakban, a nemi szervekben és a húgyutakban fordulnak elő, azonban bélből, ízületből és agyvelőből is izoláltak mycoplasmákat (3, 7). Kórokozó képességüket tekintve a kutya-mycoplasmák fakultatív patogén kórokozók, az esetek többségében multifaktoriális megbetegedésekben játszanak szerepet. M. cynos és M. canis esetében azonban igazolt önálló kórtani jelentőségük.
A mycoplasmák az egészséges kutyák felső légutaiban is megtalálhatók. Egészséges és kennelköhögésben szenvedő kutyák Mycoplasma-flórájának összehasonlító vizsgálata során azonban az utóbbi csoportban szignifikánsan nagyobb mértékű M. cynos fertőzöttséget állapítottak meg (2). A faj kórokozóképességét támasztja alá, hogy egyhetes kutyák M. cynosszal való mesterséges fertőzését követően tüdőgyulladás alakult ki (14), Golden retriever kölykökben pedig természetes fertőzés következtében tapasztaltak M. cynos által okozott letális bronchopneumoniát (20). Az M. cynos jelenlétét kimutatták szopornyicavírussal és kutya-adenovírus 2-es szerotípussal együttesen fertőzött, tüdőgyulladásban szenvedő kutyában is (4). Az M. cynos ellenanyagok kimutatására irányuló vizsgálatok eredményei alapján, a fertőzött kennelbe bekerülő kutyák közül az ott szeropozitívvá váló egyedek 80%-ában jelentkezett légzőszervi megbetegedés (15).
A mycoplasmák a kutyák nemi szerveiben is megtalálhatók. Hüvelytampon-, tasaktampon- és ondóminták vizsgálata során mycoplasmákat izoláltak a klinikailag egészséges kutyák több mint 60%-ából. A fertőzöttség mértéke szignifikánsan nagyobb volt a terméketlen, mint a termékeny kanok között. A leggyakrabban előforduló faj mindkét nemben az M. canis volt (5). Lengyelországban egészséges szukák között PCR-rel végzett M. canis felmérő vizsgálata során a hüvelytamponminták 42%-át találták pozitívnak (8).
M. canist, a légutakon, a kötőhártyán, a májon, a nyirokcsomókon, a lépen és a szívbillentyűn kívül, urogenitalis megbetegedésben szenvedő kutyákból is izoláltak (3). A klinikai képet krónikus gennyes mellékhere-, prostata- és húgyhólyaggyulladás jellemezte. Az M. canis kórtani szerepét igazolta, hogy a nyálkahártya felszínén kívül a prostatából, a mellékheréből és a krónikusan gyulladt húgyhólyag falából is izolálták, valamint az, hogy színtenyészetben mutatták ki, és a korábbi eredménytelen antibiotikumos kezelést követően a Mycoplasmára ható szer gyógyulást eredményezett (10).
Magyarországon ZÖLDÁG és mtsai (21) 1993-ban végeztek mycoplasmák kimutatására irányuló felmérő vizsgálatot szaporodásbiológiai zavarokat mutató és egészséges kutyák nemi szerveiből. Az előbbiek kórképeiben a méhgyulladás, a vetélés, a makk-, a tasakgyulladás és a kölyökelhullás dominált. Eredményeik szerint szignifikánsan nagyobb arányú a fertőzöttség a klinikailag beteg állatokban, a fertőzött kennelekben pedig gyakoribb a kölyökelhullás. Faji összetétel tekintetében az M. canis és az M. bovigenitalium nagy arányát valószínűsítették, valamennyi izolátum faji meghatározása azonban nem történt meg.
Vizsgálataink célja az volt, hogy a rutindiagnosztikai munkában a faji azonosítást néhány napon belül lehetővé tevő PCR-RFLP-módszerrel képet kapjunk az elmúlt fél évtizedben általunk kimutatott, nem haemotrop Mycoplasma törzsek faji összetételéről.
Anyag és módszer
Az MgSZH ÁDI Debreceni telephelyére 2006 és 2010 között rutindiagnosztikai vizsgálatra érkezett kutya légzőszerveiből és nemi utaiból kimutatott mycoplasmákat vizsgáltunk. Összesen 29 mintát dolgoztunk fel.
A mycoplasmákat Selective supplement-G-vel kiegészített Mycoplasma broth (Oxoid), ill. Mycoplasma agar base (Oxoid) táptalajon izoláltuk. A 16S rRNS génre tervezett Mycoplasma genusspecifikus („általános”) PCR-t KUPPEVELD és mtsai által leírt GPO3 és MGSO primerekkel végeztük (9).
A DNS kivonása Mycoplasma-levestenyészetből vagy -liofilizátumból, ill. olyan fagyasztva tárolt szervekből és váladékokból történt, amelyek általános Mycoplasma-primerrel végzett vizsgálata pozitív eredményt adott. Ezek hiányában az általános Mycoplasma-PCR céljára a minták beérkezésekor korábban kivont, fagyasztva tárolt DNS-t használtuk a reakció templátjaként. A 29 minta közül 13 esetben indultunk ki egy telepből származó mintából, 16 esetben klinikai mintából (szervdörzsölék, tamponminta, ondó).
A Mycoplasma törzseket a SPERGSER és mtsai (16) által leírt PCR-RFLP-módszert alkalmazva vizsgáltuk a következők szerint. A DNS-t Chelex-100 gyanta (Bio-Rad) segítségével tisztítottuk. A 16S-23S rRNS közötti IGS régiót az F2A (5’-GTGGGGATGGATCACCTCCT-3’) és az R2 (5’-GCATCCACCAAAAACTCTT-3’) primerpárokkal (18) erősítettük fel. A reakciót 25 µl reakcióelegyben végeztük, a következő összetételben: 25 mM MgCl2; 2,5 µl 10x puffer; 0,5 µl 10 mM dNTP; 0,6–0,6 µl 25 pmol/µl F2A és R2 primer; 0,1 µl Taq DNA polimeráz (Fermentas); 2,5 µl 100 ng/µl minta-DNS és 15,7 µl H2O. A reakciót MyCycler (Bio-Rad) készüléken végeztük a következő hőprofillal: 94 oC-on 3 percig végzett kezdeti denaturációt követően, 30 ciklusban 94 oC 30 s, 55 oC 120 s, 72 oC 120 s, majd ezt követően 72 oC 300 s végső lánchosszabbítás. A keletkezett terméket agarózgél-elektroforézissel vizsgáltuk. A termékek méretének meghatározásához 100 bp-os DNS-létrát (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas) alkalmaztunk.
Az amplikon mérete alapján két csoportot különítettünk el. A 320–380 bp körüli tartományba eső termékeket TaqI és VspI, a 250 bp körüli termékeket ApoI és DdeI (Fermentas) restrikciós enzimekkel vizsgáltuk. Valamennyi PCR-termékből 8 µl-t emésztettünk, az ApoI és DdeI enzimek esetében 4–4 U enzimmel, 20 µl végtérfogatban, a gyártó utasításai szerint, 3 órán keresztül, 37 oC-on. A TaqI és VspI enzimek esetében az emésztés két lépésben történt. Először 65 oC-on 3 órán át 4 U TaqI enzimmel emésztettünk, majd a 37 oC-ra való lehűlést követően tettük az elegyhez a 8 U VspI-t és emésztettük további 3 órán keresztül. A keletkezett fragmenteket 4%-os SeaKem LE agarózgélben futtattuk GeneRulerTM DNA Ladder Low Range (Fermentas) molekulatömeg-marker mellett. A PCR-amplikon és a hasítási termékek méretének meghatározásához a Kodak Digital Science programot vettük igénybe. A fajba sorolás a hasítási mintázat alapján történt SPERGSER eredményeivel, ill. a génbanki adatokkal összevetve.
Eredmények
A 29 vizsgálati mintából 22-t mintát vizsgáltunk meg előzetesen általános Mycoplasma-PCR-rel, amely valamennyi esetben pozitív eredményre vezetett. Tenyésztés 21 mintából történt, 19 esetben pozitív, 2-ben pedig negatív eredménnyel. A 16S-23S rRNS IGS régióra tervezett PCR 24 esetben adott pozitív eredményt, amelyből egy esetben a termék mennyisége nem volt elegendő a restrikciós enzimekkel történő vágáshoz. A termékméret alapján 15 minta tartozott a 320–380 bp közötti, 4 minta a 250 bp körüli tartományba. További 4 esetben kevert fertőzésre utaló, különböző méretű termékeket kaptunk. A kevert F2A-R2 PCR-eredmények valamennyi esetben primermintából származtak. Ezek esetében nem volt lehetséges az RFLP elvégzése. Az 1. ábra mutatja be a 16S-23S rRNA intergenikus spacer régióra tervezett PCR során keletkezett különböző méretű termékeket, amelyek valamennyi vizsgálati mintát képviselik. A 2. ábra a TaqI és VspI, valamint az ApoI és DdeI restrikciós enzimekkel végzett emésztés során keletkezett vágási mintázatokat mutatja. Eredményeinket a táblázatban foglaltuk össze.
Következtetések
Az elmúlt években, ha a rutindiagnosztikai vizsgálatra érkezett kutyák légzőszerveinek kórbonctani és kórszövettani vizsgálata során mycoplasmás fertőzés gyanúja merült fel, Mycoplasma-tenyésztést és/vagy Mycoplasma kimutatására irányuló PCR-vizsgálatot is végeztünk. A szaporodásbiológiai zavarok miatt vett és laboratóriumunkba küldött tamponminták esetében is ugyanígy jártunk el. A tüdőkben, a kórszövettani vizsgálat során, általában bronchointerstitialis pneumoniát találtunk. A megszélesbedett alveolusok falában gyulladásos sejtes, elsősorban lymphoidsejtes beszűrődést, ill. peribronchialis, peribronchiolaris és perivascularis lymphoidsejtes beszűrődéseket figyeltünk meg. Az elhúzódó esetekben, a baktériumos felülfertőződés miatt, az elváltozások már hurutos, hurutos-gennyes, esetenként kruppos jelleget mutattak.
A szaporodásbiológiai zavarok döntően a termékenyülés hiányában nyilvánultak meg. Több vizsgálatunk is pozitív eredménnyel zárult, de az izolált, ill. kimutatott fajokat nem határoztuk meg. Ennek oka, hogy az általános Mycoplasma-PCR csak szekvenálással kiegészítve, esetenként a vizsgált génszakasz nagymértékű homológiája miatt még úgy sem teszi lehetővé a faji hovatartozás megállapítását. A nukleotidsorrend meghatározásának költségeit a tulajdonosok rendszerint nem vállalják. Az egyes fajok tulajdonságainak, a kórokozók járványtani szerepének megismeréséhez azonban szükséges a faj meghatározása is. Ezt a hiányosságot pótoltuk a 16S-23S rRNS IGS-t felerősítő PCR-RFLP-módszer segítségével elvégzett retrospektív vizsgálatainkban.
A klinikai tüneteket mutató kutyák légutaiból M. canis, M. maculosum és M. spumans fajokat mutattunk ki hat állományból. Újabb hat állományból származtak a nemi utakból vett minták, amelyekben M. canis, M. cynos, M. edwardii és M. mucosicanis sp. nov. fajokat találtunk. A korábban közölt vizsgálatokban (5, 21) tapasztaltakhoz hasonlóan, az utóbbi csoportban leggyakrabban előforduló faj az M. canis volt.
Mindössze egy tenyészetben (J jelzésű tulajdonos) tapasztaltunk légúti és szaporodásbiológiai problémákat is. Kéthetes, angol bulldog kölyökkutyahulla kórbonctani és kórszövettani vizsgálata során kiterjedt interstitialis tüdőgyulladást és súlyos, heveny tüdővizenyőt állapítottunk meg. A hasi parenchimás szervek és a tüdők tenyésztéses bakteriológiai vizsgálata is negatív eredménnyel zárult. A tüdőkben talált kórszövettani elváltozások miatt felmerült a Mycoplasma-fertőzés gyanúja is, ezért elvégeztük a mycoplasmák kimutatására irányuló molekuláris biológiai (általános PCR) vizsgálatot is, amely vizsgálat pozitív eredményre vezetett. Ugyanezen állományból, közel egy éven belül történt négy ondóvizsgálatban ismételten M. cynost határoztunk meg. A hulla tüdejéből származó faj meghatározása nem történt meg a tipizáló PCR eredménytelensége miatt, azonban valószínűsíthető, hogy a légzőszervi patogénnek tartott M. cynos okozta a légzőszervi elváltozásokat.
További egy kennelben, két hónapos különbséggel, kétszer M. canist mutattunk ki. A törzsek kennelen belüli fennmaradását tapasztalták MANNERING és mtsai (11) is, amikor ugyanazon kennelből, 4–8 hónapos különbséggel, genetikailag megkülönböztethetetlen M. cynos törzseket izoláltak, míg az egyes kutyák mindössze 8–16 napot tartózkodtak az állományban. A jelenség oka lehet a tünetmentes állatokban való passzálódás, valamint a környezetből történő visszafertőződés. A körülményektől függően a mycoplasmák akár hetekig is életképesek lehetnek a gazdaszervezeten kívül (12), M. cynost pedig a kennel levegőjéből is ki lehetett mutatni (2).
A kutya Mycoplasma-fertőzéseiben általában több faj mutatható ki (3, 16). A saját vizsgálatainkban a PCR-pozitív eredményt adó 11 klinikai minta (szervdörzsölék, tamponminta, ondó) közül 4 esetben kevert fertőzésre utaló PCR-eredményt kaptunk.
Két további, garattamponból származó minta esetében, a PCR-termék restrikciós enzimekkel történő vágását követően, a keletkezett fragmentek mérete egyik általunk vizsgált fajra sem volt jellemző. Ennek oka lehet egy, a kutyákban nem jellemzően előforduló vagy eddig le nem írt Mycoplasma-faj jelenléte. A faj azonosításához a továbbiakban a termék szekvenálását és az izolátum szerológiai vizsgálatát lenne célszerű elvégezni. A jelenség nem egyedi. CHALKER és mtsai (2) az általuk vizsgált egészséges és kennelköhögésben szenvedő állatokból származó mandulatamponok esetében a kitenyésztett mycoplasmák 15,5, ill. 32,6%-át nem tudták azonosítani PCR-rel, amit a potenciálisan új mycoplasmák jelenlétével magyaráztak. Ezzel ellentétben, a hörgőkből és a légcsőből származó minták esetében az azonosítatlan mycoplasmák aránya mindössze 2,8, ill. 2,9% volt.
Öt minta esetében a 16S-23S rRNS IGS régióra tervezett PCR negatív eredményre vezetett. A reakciók kiindulási anyaga valamennyi esetben többéves DNS-minta volt, amely az évekkel korábban végzett általános Mycoplasma-primerrel pozitív eredményt adott. Feltételezzük, hogy a mintatárolás során bekövetkezett DNS-degradáció áll a negatív eredmény hátterében.
A 16S-23S rRNS IGS-t felerősítő PCR gyors és hatékony módszere a Mycoplasma-faj meghatározásának egy faj által előidézett fertőzéseknél klinikai mintákból, ill. tiszta izolátumból. A kevert fertőzés gyakorisága és a szerológiai módszerekkel történő azonosíthatóság érdekében azonban továbbra is szükségesnek tartjuk a tenyésztés megkísérlését, amelynek eredményeként tiszta tenyészetben vizsgálhatjuk az izolált törzseket, és a kezelés megkönnyítését lehetővé tevő antibiotikum-érzékenységi vizsgálatokat is elvégezhetjük.
Mintáink klinikai tüneteket mutató állatokból származtak, többnyire eredménytelen gyógykezelést követően került sor a vizsgálatra. A szaporodásbiológiai zavarokat mutató kutyák esetében, a Mycoplasma-kimutatást követő célzott antibiotikumos kezelés eredményeképpen, jelentős javulás következett be. Több kórbonctani mintában állapítottuk meg a tüdő Mycoplasma-fertőzöttségét. Mindezek a tények arra hívják fel a figyelmet, hogy a mycoplasmák, vitatott jelentőségük ellenére sem elhanyagolható kórokozók, amelyekre gondolnunk kell a helyes kórjelzés és a kezelés megválasztása során.
Köszönetnyilvánítás
Köszönetet mondunk RENDESNÉ SZÉKELY ÉVÁnak a vizsgálatok kivitelezésében nyújtott munkájáért.
Szerzők: Matiz Katalin, Kecskemétiné Turcsányi Ibolya, Bacsadi Árpád, Bajmócy Endre, Kecskeméti Sándor
